泻药。手机码字没图。

Golden gate 的方法跟传统的分子克隆的方法的优势相比在于可以实现片段的边切变边连,节省时间，同时可以连个多个片段的连接。

这方法之前应该是合成生物学尝试合成基因组的时候做的一个方法(好奇他们完全不把表观遗传放在眼里)，具体怎么来的可能要查下文献。

具体到原理：一般的内切酶分为三种，通常用的是2类的酶，识别特定的回文序列，并从中切开。而golden gate一般用的是3类酶，一般以bsmb 1，Bsa1, Bbs1这三种酶，识别特定的序列，并在特定序列以后隔几个任意的碱基切开，这样子就可以克服2类酶必须要回文序列才能用的缺点，实现片段的连接。

然后接下来是后面的连接酶，传统的连接酶是T4用的比较多，T4可以连接黏性末端跟平末端，而golden gate里用的是T7，它的特点是只能实现连接黏性末端。因为T7的这一特性，所以在连接的时候可以把片段跟切好的载体混到一种特殊的buffer里，在这里内切酶跟T7都可以保持比较高的活性，通过温度的调节，实现克隆的构建。因为用的是T7，所以不用担心PCR片段自连降低克隆效率，又因为是用的三类酶，可以通过黏性末端的设计，可以一种酶切多个片段，又不用担心这几个片段之间的乱连，来达到分子克隆的目的。

实际上T4跟传统的内切酶也可以来做golden gate，具体就不多说了。