从1987年首次发现CRISPR，到最近几年CRISPR-associated(Cas)技术的广泛应用，短短几年时间，CRISPR技术使基因编辑成为科研界的热门内容。那么CRISPR到底是怎么一回事儿呢？
下面我将分为背景简介、工作原理及应用方向三个方面来进行介绍。
为响应入侵病毒和质粒的侵害，细菌和古菌能够将外源DNA整合进自身染色体，整合后的序列作为一种“免疫记忆卡片”，在遇到与该序列互补的外源DNA后，能够对其进行切割。而这种整合后的序列就叫规律成簇的间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat ,简称CRISPR），是细菌和古菌的一种自我保护机制。
CRISPR/Cas由分布在操纵子区域的多种Cas基因和CRISPR单元组成。CRISPR单元则由富含AT的前导区（被认为是CRISPR的启动子区域）、基因组靶向序列（genome-targeting sequences，称spacers）和多个相同的重复序列（repeats，约20~50-nt）组成，spacers之间被repeats隔开，呈repeat-spacer-repeat-spacer-repeat- spacer-repeat-……分布。
CRISPR/Cas介导的免疫防御系统依赖小RNA识别入侵者的特定序列（protospacers），并使其沉默表达，这种免疫反应主要包括三个阶段。
首先是适应期，细菌和古菌拥有一个或多个能够响应病毒或质粒入侵的CRISPR位点，它们通过类似于外源标记的方式来响应这种入侵，即将外源基因的短片段（protospacers）整合到宿主染色体的CRISPR序列前导区的近端（如第一个spacer），实现标记功能。第二三阶段属于宿主的反击，Cas基因被翻译成蛋白质，CRISPR单元被转录成CRISPR
RNA前体物(pre-crRNA)，然后通过酶加工成成熟的能够与入侵者protospacers序列互补配对的crRNAs，这个过程相当于将靶标锁定。与靶标结合后，crRNAs通过与Cas蛋白形成的复合物来指导外源基因的沉默，从而达到免疫作用。
这种特殊的免疫系统主要有三种主要的类型，并且在一个生物体内三种类型能够兼容，Cas1基因存在于所有的CRISPR系统中。Type I有一个相同的特征——编码一个Cas3基因；Type II由四种Cas组成，Cas9是其中一；Type III可分为两种亚型，III-A和III-B，前者能够在体内靶向质粒DNA，后者能够在体外切割单链RNA。在基因编辑的应用中，运用最广泛的是Type II CRISPR系统。
在TypeII CRISPR系统中，一种与转录相关的tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA）与repeats区杂交，形成一条RNA双链，被内源的RNase III等酶切割并被加工。成熟的crRNA-tracrRNA复合物与Cas9蛋白形成复合体，实现靶向序列双链DNA的切割从而介导免疫应答。
那么为了防止对自身的DNA进行切割，Cas9是如何区分自身DNA和外源DNA的呢？首先crRNA能够与外源DNA5'端20-nt的碱基序列互补配对，在这段靶向序列附近，一段短的DNA序列（protospacer adjacent motif，PAM），是帮助Cas9区分异源的重要元件。
在CRISPR/Cas9系统中，PAM 区是-NGG序列，而Cas9的切割位点则在NGG5’端的第三个碱基，这意味着Cas9能够被开发成RNA引导的（RNA-guided）基因编辑系统。
目前，融合了包含靶基因序列的crRNA和tracrRNA的单个向导RNA（Single guide RNA,
sgRNA），以及能够表达Cas9蛋白的载体已经被广泛用于基因编辑。如果感兴趣的DNA序列中包含NGG，那么Cas9就能够以NGG 5'端的20-nt序列为靶标来切割目标DNA双链。
Cas9是一种常用的核酸酶工具，能够用来修饰多种生物的基因组序列。在sgRNA（含有20-nt能够与靶基因互补的序列）的引导下，Cas9特异性的切割靶标序列，造成DNA双链的断裂（double-strand DNA breaks，DSBs），从而引起生物体内的DNA损伤修复。
这种修复作用主要包括两种途径，一种是利用非同源重组 (NHEJ)的修复，即易错修复，可能造成基因组的插入或缺失突变，这种方式常导致靶基因失去功能。另一种是利用同源重组修复（HDR），即精准修复，能够借助外源引入的短单链DNA序列（SSOND）或质粒（donor）为模板，介导替换或插入。
除了基因编辑方面的应用，Cas9还能用于转录调控，这种应用依赖于Cas9蛋白结构的解析。Cas9作为一个多功能蛋白，拥有HNH和RuvC两个核酸酶结构域，HNH结构域切割切割与crRNA互补配对的DNA链，RuvC结构域则切割双链DNA的另一条链。
如果突变两个结构域的其中一个，Cas9则变成单链切割的蛋白，如果将两个结构域都突变，那么Cas9则变成只有NDA结合活性的蛋白质（DeadCas9，dCas9；Asp10 → Ala, His840 → Ala）。
当dCas9结合在基因的编码区或启动子区域时，会影响RNA聚合酶的活性，从而影响转录，这种方法也称为CRISPRi。在人类和酵母中，如果将dCas9蛋白与VP64或KRAB融合表达，会分别带来转录激活和转录抑制的作用。
CRISPR/Cas9系统具有非常广泛的应用，总体而言主要有四个方面的应用：
1.基因编辑（基因敲除/插入/替换/修饰）；
2.基因表达调控（转录激活/抑制）；
3.表观遗传学修饰；
4.基因组成像等
然而，CRISPR/Cas9系统也存在无法避免的短板，那就是脱靶效应（Off-Target），这种脱靶结合可能发生在sgRNA位点和可被替换的PAM区。但提高CRISPR/Cas9特异性的方法也应运而生，其中最重要的一个考虑因素就是选择合适的靶基因序列。
尽管如此，CRISPR/Cas9基因编辑技术为人类基因治疗领域带来了新的曙光，同时，更多的CRISPR系统在不断被发掘，更完美的基因编辑技术在路上……