撰文 | Qi
责编 | 兮

干扰素基因刺激蛋白（Stimulator of interferon genes, STING）是人类细胞中的一种可感知细菌感染过程中释放的外来环二核苷酸，以及病毒感染和抗肿瘤免疫过程中的内源性环状GMP-AMP（cGAMP）信号传导的受体【1】。截至目前，已有诸多研究证实cGAS（cyclic GMP–AMP synthase）-STING通路作为动物的细胞自主性固有免疫系统的核心成分。


越来越多的证据表明，真核生物固有免疫系统的重要组成部分在细菌免疫系统中均具有对应的部分。例如，Argonaute已被证明是植物，昆虫和动物的抗病毒RNA干扰机制中的核心蛋白，也有报道指出它在细菌和古细菌中同样具有免疫作用【2-4】。2019年发表在Nature杂志上的一项研究【5】发现原核生物中cGAS信号传导具有与真核生物相似的抗病毒作用。这些结果引出一种假设，即这些在原核生物中首先进化为抵抗噬菌体的防御手段，被古代的真核生物所继承，并奠定真核生物原始免疫系统的基础。然而，由于STING蛋白与其他已知的信号蛋白没有结构同源性，其功能分析受到限制，且无法解释哺乳动物固有免疫中环状二核苷酸信号的起源【6-9】。

2020年9月2日，来自美国哈佛医学院的Philip J. Kranzusch课题组在Nature上发表了题为“STING cyclic dinucleotide sensing originated in bacteria”的文章，该研究通过对细菌STING蛋白晶体结构的分析，解释了STING依赖性信号传导的机制，并揭示原核生物抗噬菌体防御中功能性cGAS-STING通路的保守性【10】。

研究人员通过对原核生物噬菌体防御岛的生信分析，得出一组具有STING同源性候选蛋白的差异性基因。为了解STING在细菌信号传导中的潜在作用，研究人员首先确定黄杆菌科（Flavobacteriaceae sp.）和颗粒二氧化碳噬纤维菌（Capnocytophaga granulosa）中候选STING同源物的1.8Å和2.8Å晶体结构。

通过确定与3', 3'-cGAMP形成复合物的黄杆菌科STING（FsSTING）结构，证实细菌STINGs是功能性环状二核苷酸受体，且具有典型的类似于人STING蛋白中观察到的“V形同型二聚体”和“疏水性α-helix”的结构。

尽管整体结构与人STING保持一致，但细菌STING蛋白体积却相对小20％，且结构更为紧凑。此外，差异还表现为β链盖结构域内的延伸，诱导自噬所需的末端α-螺旋的添加以及脊椎动物中激酶和转录因子募集所需的无结构的C末端尾巴（见下图1）。

随后，研究人员分析细菌STING序列发现，84％在环状寡核苷酸的信号系统（Cyclic Oligonucleotide-Based Signalling System, CBASS）操纵子中编码。类似于cGAS依赖的人类细胞中对病毒复制的感知，CBASS免疫依赖于CD-NTase（cGAS/DncV-like nucleotidyltransferases）的激活来引发第二信使依赖性抗病毒效应子应答。

研究人员克隆了黄杆菌科的CD-NTase CdnE，并观察到FsCdnE特异性合成用于调节细菌生长和细胞内信号传导的常见核苷酸第二信使，环状二鸟苷酸（c-di-GMP）。随之，分析所有包含STING的CBASS操纵子的基因组背景，发现细菌中含有STING的CBASS操纵子主要存在于拟杆菌（Bacteroides）中，进一步确认几乎完全在缺乏经典GGDEF（Gly-Gly-Asp-Glu-Phe）和EAL（Glu-Ala-Leu）c-di-GMP信号域的细菌中编码。

接下来，研究人员通过突变分析，验证STING环状二核苷酸结合口袋中残基的重要性，并确认了c-di-GMP识别需要保守的核碱基接触。人STING不会与环状二核苷酸形成明显的序列特异性接触。取而代之的是，人STING残基R232与磷酸二酯骨架存在额外接触，且对于cGAS产物2', 3'-cGAMP的高亲和力识别至关重要，而细菌STING受体的显着特征是无法识别哺乳动物2', 3'-cGAMP。

细菌STING主要是与Toll/Interleukin-1 receptor（TIR）适配结构域以融合形式出现，或更罕见地附加到预测的跨膜片段上。已知TIR结构域可在植物和动物免疫反应中充当NAD +水解酶，因而研究人员测试了粪便鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium faecium）全长TIR-STING融合蛋白（SfSTING）的催化功能，并观察到NAD +迅速水解为烟酰胺和腺嘌呤二磷酸核糖。由于细菌的TIR-STING激活需要<100 nM c-di-GMP，研究人员在合成c-di-GMP的大肠杆菌细胞中表达了SfSTING，并观察到有效的生长抑制作用。这些结果提示，细菌STING在CBASS介导的免疫反应中作为c-di-GMP响应的 NADase效应子。

此外，研究人员发现环二核苷酸识别可驱动细菌STING寡聚化，且负染电镜分析表明，SfSTING仅在存在c-di-GMP的情况下才能形成稳定的细丝。在没有细丝形成的情况下，所有的SfSTING NADase活性都会丧失，这一结果证实c-di-GMP诱导的寡聚化对于TIR结构域激活和效应子功能是必不可少的。

最后，研究人员根据结构分析构建103个细菌和492个后生动物的STING蛋白的系统发育树，以比对STING在不同物种间的功能性和适应性，并确认固有免疫中环二核苷酸传感的起源模型（见下图2）。首先，通过对细菌、牡蛎、海葵和人类STING晶体结构的直接比较，揭示细菌与后生动物之间特定的环状二核苷酸接触的保守性以及磷酸二酯键识别的关键差异。

随后，研究人员进一步确认太平洋长牡蛎的全长TIR-STING融合体的2.4 Å晶体结构，发现与最近对人类STING的冷冻电镜分析不同【11】，在存在2', 3'-cGAMP的情况下，连接牡蛎STING和TIR结构域的接头并未观察到180°旋转，而是STING与TIR的单体接触发生重排，TIR结构域向下旋转4°。此外，在环状二核苷酸存在的情况下，牡蛎TIR-STING并未表现出催化NAD +裂解活性。以上结果均表明STING蛋白在后生动物中的适应性，并提示STING环状二核苷酸感测如何在结构上传递给附加的效应子模块。

总体来看，这项研究提出了以下几个有趣的观点：

1）细菌STING蛋白作为c-di-GMP的受体，主要在拟杆菌属的基因组中编码，而拟杆菌类则随着人类和动物微生物群落的富集而生长；
2）c-di-GMP是第一个发现的人类STING配体，人类STING对细菌环状二核苷酸的识别对于免检测细胞内病原体（如单核细胞增多性李斯特氏菌）至关重要。因此，获得作为c-di-GMP受体的STING可以提供直接选择优势，使动物细胞能够通过检测原核生物中保守的环二核苷酸第二信使来感知细胞内细菌；
3）文章中通过结构分析定义了环状二核苷酸结合口袋突变，该突变使后生动物STING适应内源性2', 3'-cGAMP信号的识别，并为后生动物STING特异性插入的出现引发自噬和I型干扰素依赖性反应提供解释。


综上所述，这项研究定义了在细菌和人类细胞中共享的STING依赖性信号传导的保守机制，并通过统一模型来解释动物固有免疫中环状二核苷酸感测的发生。综合先前在原核生物抗病毒免疫中鉴定出的多种cGAS同源物[5, 12, 13]，细菌中STING的功能保守性揭示了控制人类cGAS-STING信号传导的每个核心蛋白成分均来自古老的噬菌体防御机制。

原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2719-5

制版人：琪酱

参考文献

1, Ishikawa, H. & Barber, G. N. STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signalling. Nature 455, 674–678 (2008)
2, Joshua-Tor, L. & Hannon, G. J. Ancestral roles of small RNAs: an Ago-centric perspective. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003772 (2011).,
3, Swarts, D. C. et al. DNA-guided DNA interference by a prokaryotic argonaute. Nature 507, 258–261 (2014).,
4, Olovnikov, I., Chan, K., Sachidanandam, R., Newman, D. K. & Aravin, A. A. Bacterial argonaute samples the transcriptome to identify foreign DNA. Mol. Cell 51, 594–605 (2013).
5, Cohen, D. et al. Cyclic GMP-AMP signalling protects bacteria against viral infection. Nature 574, 691–695 (2019)
6, Ouyang, S. et al. Structural analysis of the STING adaptor protein reveals a hydrophobic dimer interface and mode of cyclic di-GMP binding. Immunity 36, 1073–1086 (2012).
7, Zhang, X. et al. Cyclic GMP-AMP containing mixed phosphodiester linkages is an
endogenous high-affinity ligand for STING. Mol. Cell 51, 226–235 (2013).
8, Kranzusch, P. J. et al. Ancient Origin of cGAS-STING Reveals Mechanism of Universal 2′,3′ cGAMP Signaling. Mol. Cell 59, 891–903 (2015).
9, Shang, G., Zhang, C., Chen, Z. J., Bai, X. C. & Zhang, X. Cryo-EM structures of STING reveal its mechanism of activation by cyclic GMP-AMP. Nature 567, 389–393 (2019)
10, Morehouse, B. R. , Govande, A. A. , Millman, A. , Keszei, A. F. A. , Lowey, B. , & Ofir, G. , et al. (0). Sting cyclic dinucleotide sensing originated in bacteria. Nature.
11, Shang, G., Zhang, C., Chen, Z. J., Bai, X. C. & Zhang, X. Cryo-EM structures of STING reveal its mechanism of activation by cyclic GMP-AMP. Nature 567, 389–393 (2019)
12, Whiteley, A. T. et al. Bacterial cGAS-like enzymes synthesize diverse nucleotide signals. Nature567, 194–199 (2019).
13, Lowey, B., Whiteley, A. T., Keszei, A. F. A., Morehouse, B. R., Mathews, I. T., Antine, S. P., Cabrera, V. J., Kashin, D., Niemann, P., Jain, M., Schwede, F., Mekalanos, J. J., Shao, S., Lee, A. S. Y. & Kranzusch, P. J. CBASS Immunity Uses CARF-Related Effectors to Sense 3′-5′- and 2'-5′-Linked Cyclic Oligonucleotide Signals and Protect Bacteria from Phage Infection. Cell (2020) 182, 38–49 e17