梅衣属

ITS

条形码物种的快速鉴定

实验目的：

一、学习并熟练地衣

DNA

提取技术

二、掌握

PCR

技术的原理及操作

三、

DNA

条形码技术的应用

实验技术路线：

1

、地衣总

DNA

的提取

2

、

PCR

扩增

3

、基因测序

4

、基因序列对比

地衣总

DNA

提取：

1.

取带有子囊盘或未有子囊盘的带藻地衣体

30~300mg

，用无菌水冲洗，除去表面杂质，

再用

DNA

提取液浸泡

2~3h

（4℃）。

2.

将地衣体取出，滤纸吸干表面液体，剪碎放于预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末

状。

3.

将粉末小心、全部转入

1.5ml

离心管中，加入

400μL  DNA

提取液，混匀。

4.

加入

10% SDS 50μL 、氯化苄

150μL，振荡混合，于

50℃保温

1h

，每隔

10min

振

荡混合一次。

5.

保温

1h

后，每管加入

3mol/L NaAc 50μL，混匀冰浴

15min.  

6.

用等体积

酚：氯仿：异戊醇（

25

：

24

：

1

）和等体积

酚：氯仿（

1

：

1

）各抽提一次，

直至无白色沉淀为止。

7.

移上清液于另一离心管，加入

2

倍体积无水乙醇，4℃放置

2~3h 

，

15000r/min

，离

心

10min

（4℃），弃上清液。

8.

将沉淀用

70%

乙醇冲洗

2

次后，真空干燥，再加入

50~80μL TE

缓冲液，保存于冰

箱（4℃）

PCR

扩增：

稀释

50 

倍用于后续

 PCR 

操作。真菌

 ITS rDNA 

由通用引

物

 ITS5 

（

 5

′

-

GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3

′

）、

 ITS4 

（

 5

′

-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3

′

）。

PCR 

反应条件：95℃预变性

 5min

；

95℃变性

 30s

，52℃退火

 30s

，72℃延伸

 2min

，

反应

 32 

个循环；72℃延伸

 10min

，4℃保存。反应结

束后，

PCR 

产物通过

 0.8%

的琼脂糖

凝胶电泳检验

,ABI3730DNA 

分析仪测序。

序列比对：

所获测序结果序列包含小亚基部分结尾序列、

ITS1-5.8S-ITS2

、大亚基部分起始序列，

去除大小

亚基部分序列后所得片段大小约

 500bp

，即为所需的序列

利用

 DNAMAN

（

Lynnon Biosoft

）软件将测序结果同

 GenBank 

下载数据进行

比对分析，

如果序列长度不同，则只保留共有区段。

如果该

DNA

序列与

GenBank

中梅衣属的某个种的序列相同，则可确定所测定的地衣是

哪个种。

实验试剂：

一、

DNA

提取

  1

、

DNA

提取液（

50mmol/L Tris HCL pH9.0;12.5mmol/L EDTA pH8.0

）

: 

（

1

）称取

7.5712gTris,

加入

150ml

蒸馏水，加

HCL

调

pH

至

9.0

，定容至

250ml 

（

2

）称取

3.6531gEDTA

，加入

20ml

蒸馏水，调

pH

至

8.0

，定容至

250ml 

  2

、

10%SDS:

称取

10gSDS

，加入

100ml

蒸馏水

  3

、

NaAc

：

0.51g

醋酸钠固体，加蒸馏水溶解，定容

25ml 

  4

、

TE

缓冲液：（

1

）

1mol/L  Tris-HCL(pH8.0)  1ml