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赵颖豪，刘兴宇，吕莹，谭泽宝，吴昊宇，边晓垄，齐志雅，张沥匀
2024,51(5):1391-1404, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240145
Abstract:
【背景】 煤炭作为重要的能源物质，在生产活动中需求量巨大，但长期的煤炭开采会对矿区生态环境带来极大破坏。微生物修复作为一种对环境友好、操作简单、经济成本低的修复方式，在煤矿区生态系统恢复中有广泛的应用前景。【目的】 利用微生物复合菌剂对煤矿区排土场地进行修复。通过微生物的代谢活动以及与植物根系的相互作用，实现修复煤矿破碎生态环境的目的。【方法】 借助16S rRNA基因高通量测序技术对修复场地微生物群落结构进行分析。通过监测试验场地土壤营养成分、重金属含量以及场地荞麦植株生长状况，评价了微生物修复效果，并初步探究了微生物所发挥的功能。【结果】 试验场地中存在有多种具有修复能力的菌种，微生物菌剂的加入降低了试验场地微生物多样性，但对土著微生物群落结构的影响较小。经过150 d的现场修复，场地有机质含量提高70%、总氮含量提升20%、总钾含量提升48.4%。速效氮、磷、钾也分别提升40%、26.8%和24.2%，土壤肥力得到显著恢复。场地有机质、速效磷和速效钾含量在修复期内呈现出增长趋势，表明功能微生物持续为植物生长提供高效的营养物质。场地砷含量降低49%，铜含量降低41%，表明微生物对场地(类)重金属起到了修复作用。微生物通过促进植株根系生长，提高了植株对营养物质的吸收和利用，场地荞麦株高提高30%，干重提升100%，粗蛋白含量提高22.4%。【结论】 微生物菌剂显著提高了试验场地的土壤肥力，抑制了土壤重金属毒害作用，并有效地促进了场地经济作物的生长。微生物修复在煤矿区破损生态系统的恢复上具有巨大的应用价值。
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2024,51(5):1405-1424, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240212
Abstract:
【背景】 2022年8−9月，从甘肃省兰州市种植的食用向日葵田中采集到零星发病的叶斑和盘腐病害标样。【目的】 明确叶斑病和盘腐病的病原及其生物学特性。【方法】 采用单孢分离法进行病原菌分离；通过Koch’s法则明确分出病菌的致病性；采用形态学和分子生物学方法对病原菌进行种类鉴定；通过平板法测定试验菌株的适宜生长温度；观察经30 ℃ (生长抑制温度)培养后试验菌株产菌核特性的变化。【结果】 分离得到12株菌落形态不同的葡萄孢属菌株。试验菌株SKY-A−SKY-D接种食用向日葵离体叶片和花盘可引起与自然发病相似的症状，接种发病的叶片和花盘病组织上原接种菌的分出率达100%。试验菌株在PDA平板上15 ℃和20 ℃培养10−40 d，大型分生孢子无色至淡褐色，单胞，卵圆形、长椭圆形、球形、近球形、棒状或不规则形，[6.0−14.2 (−20.1)] μm×[6.0−10.4 (−14.9)] μm；菌核表生，黑色，球形、近球形、椭圆形或不规则形，(0.5−11.1) mm×(0.5−5.0) mm；Ⅰ型微菌核红褐色至黑褐色，表生或埋生，(26.9−492.5) μm×(14.9−149.3) μm，微菌核的组成细胞大小为(12.7−35.0) μm×(11.9−25.3) μm；Ⅱ型微菌核近黑色，埋生，(35.8−373.1) μm×(23.9−229.9) μm，微菌核的组成细胞大小为(8.2−16.4) μm×(8.2−14.9) μm；假微菌核由特化的附着胞构成，暗褐色至近黑色，埋生，(32.0−447.8) μm×(19.4−358.2) μm。试验菌株的菌丝适宜生长温度为20−25 ℃；菌核产生温度为5−25 ℃。30 ℃培养7 d后转至20 ℃培养14 d，可诱导2个不产菌核的菌株SKY-B和SKY-C产生菌核，突变株在继代培养时保持其产菌核能力。BLASTn分析结果显示，试验菌株SKY-A–SKY-D的rDNA-ITS序列(国家微生物科学数据中心登录号为NMDCN00038NP–NMDCN00038NS)与已知灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)序列的相似性达99.8%–100.0%。g3pdh、hsp60和rpb2多基因系统发育分析结果显示，4个试验菌株被聚在B. cinerea的不同亚群里。【结论】 引起向日葵叶斑和盘腐的病原菌被鉴定为B. cinerea，这是灰葡萄孢菌引起向日葵叶斑病和盘腐病在我国西北地区的首次报道。首次发现灰葡萄孢菌可以产生2种类型的微菌核。30 ℃热胁迫处理可诱导不产菌核的灰葡萄孢菌产生菌核，突变株的产菌核能力可遗传。
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2024,51(5):1425-1440, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230674
Abstract:
基因编辑技术的应用使对丝状真菌进行高效、精准的基因改造成为可能。然而，在实际实验操作过程中，仍然存在很多影响因素，导致同源重组介导的精准基因编辑的效率很低。本文对目前提高丝状真菌精准编辑效率的方法进行了总结，使基因编辑方法更好地应用于丝状真菌的菌种改造。
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2024,51(5):1441-1459, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230667
Abstract:
群体感应是微生物群体之间的一种交流机制。根据信号分子的识别，微生物可以进行种群内以及种群间的信息交流，并调控自身的生理行为。而群体淬灭可以通过打断群体感应信号分子的合成、分泌与识别进程，从而阻断群体感应。在微藻和细菌的互作过程中，群体感应和群体淬灭的共同作用调控着微藻和细菌的生理变化，使得它们达成生态平衡而共存。本文综述了群体感应的发生过程与检测，并阐述群体感应在微藻和细菌互作中的作用。同时，论述了群体淬灭的发生机制，并探讨群体淬灭在微藻和细菌互作中的作用与生态效益。以期为更全面地了解藻菌关系的复杂联系、进一步揭示藻菌互作的分子机制及在海洋生态系统中的作用提供借鉴。
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2024,51(5):1460-1470, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230544
Abstract:
Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system, T4SS)是广泛存在于细菌中的特殊蛋白分泌系统，不同于其他分泌系统，该系统不仅能够转运蛋白质，还能转移DNA、DNA-蛋白质复合物。因此，T4SS具有多种生物学特性。T4SS能介导细菌的接合作用，而接合是水平基因转移(horizontal gene transfer, HGT)的重要机制之一，细菌能够利用T4SS介导的接合作用转移大部分可移动基因元件(mobile genetic element, MGE)，如接合型质粒和整合性元件，从而使细菌获得新的基因，这些辅助基因在特定环境条件下有益于帮助细菌获得新功能，有助于细菌在新环境中占据生态位，极大地促进了细菌对环境条件变化的适应性。本文主要对细菌T4SS的生物学作用研究进展进行综述，并探讨了T4SS在细菌适应重金属环境中的作用。
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2024,51(5):1471-1481, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230361
Abstract:
死亡时间的推断一直是法医学鉴定中的重要内容之一。近年来，随着高通量测序技术的不断成熟、生物信息学和机器学习方法的迅猛发展，基于尸体微生物群落结构的变化研究为推断死亡时间提供了一种新的可能性。微生物群落随腐败时间推进的演替规律可以用于死亡时间的推断。本文从尸体腐败现象的本质入手，总结了利用尸体微生物推断死亡时间研究的技术方法和实际应用，并对尚存在的问题和应用前景进行了展望。
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2024,51(5):1482-1494, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230551
Abstract:
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的世界范围内广泛流行的重要人畜共患传染病。外膜蛋白作为布鲁氏菌重要毒力因子，不仅在宿主感染过程中起着关键作用，还是布鲁氏菌潜在免疫原和保护性抗原，能刺激机体产生较强免疫应答，可作为布鲁氏菌的诊断抗原和新型疫苗靶点。本文对布鲁氏菌外膜蛋白免疫原性的研究进展进行了总结，以期为布鲁氏菌的实验室诊断和新型疫苗研发提供参考。
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2024,51(5):1495-1511, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230558
Abstract:
重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)技术是一种利用重组酶(T4 UvsX)、单链DNA结合蛋白(T4 Gp32)和链置换DNA聚合酶(Bsu)等蛋白在恒温条件下扩增核酸的技术。由于其可以恒温、高效地扩增靶核酸片段，近几年在细菌、病毒、寄生虫、支原体、衣原体检测方面发挥着独特的作用，逐渐成为床旁检测(point-of-care testing, POCT)的重要技术。本文以RPA技术的原理为起点，对其临床应用、不足之处及改进方法进行阐述，以期为临床疾病的快速检测和诊断方面提供新思路。
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2024,51(5):1512-1521, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230929
Abstract:
【背景】 (S)-乙偶姻是一种重要的精细化学品，开展其绿色高效合成具有重要的应用价值。【目的】 祖先酶可能具有较好的热稳定性。论文以筛选高活性和稳定性的祖先羰基还原酶为目标，并探究其酶学性质，实现(S)-乙偶姻的高效酶法合成。【方法】 基于祖先序列重建法的基因挖掘策略筛选双乙酰还原酶，并对其进行了酶学性质表征，构建不对称还原双乙酰合成(S)-乙偶姻的反应体系。【结果】 获得了一种可以不对称还原双乙酰合成(S)-乙偶姻的祖先羰基还原酶AncBDH1，并在Escherichia coli中实现可溶性表达。序列保守性分析显示，AncBDH1含有短链醇脱氢酶家族的特征基序，且与已报道羰基还原酶的同源性均较低。对AncBDH1进行了镍柱纯化和酶学性质表征，显示其仅可利用NADH为辅酶，最适反应pH值为7.0，最适反应温度为60 ℃，催化活性不依赖金属离子，并且表现出对二甲基亚砜等有机溶剂的良好耐受性。AncBDH1可以在12 h内将200 mmol/L双乙酰完全转化为(S)-乙偶姻。【结论】 发现了一个具有较高的最适温度及有机溶剂耐受性的祖先羰基还原酶AncBDH1，并实现了(S)-乙偶姻的高效酶法合成，为(S)-乙偶姻的酶法合成奠定了一定的研究基础。
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2024,51(5):1522-1535, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230693
Abstract:
【背景】 谷氨酸脱羧酶广泛存在于生物体内，其催化产物γ-氨基丁酸是哺乳动物重要的抑制性神经递质。目前，微生物来源的谷氨酸脱羧酶在热和酸碱条件下仍不够稳定。【目的】 挖掘肠道微生物的谷氨酸脱羧酶基因，异源表达并研究其酶学性质，为γ-氨基丁酸的生物合成提供酶原。【方法】 从倭蜂猴粪便微生物宏基因组扩增谷氨酸脱羧酶基因，在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行异源表达、酶学性质研究及全细胞合成γ-氨基丁酸的应用。【结果】 获得谷氨酸脱羧酶基因Xby1_8，重组酶Xby1_8分子量为54.46 kDa，最适作用条件为pH 5.0、55 ℃，Km和Vmax分别为(10.2±1.5) mmol/L和(3 574.0±198.3) μmol/(min·mg)，较其他微生物来源的谷氨酸脱羧酶具有最高比活3 106.2 U/mg。Xby1_8具有较好的pH和温度稳定性，pH 4.0–8.0或30–50 ℃处理1 h，剩余酶活仍高于100%。在l-谷氨酸浓度260 mmol/L，反应温度55 ℃，细胞浓度OD600为3.5条件下反应2.5 h，重组菌E. coli/Xby1_8全细胞催化制备γ-氨基丁酸的转化率为100%。【结论】 从粪便微生物宏基因组中获得谷氨酸脱羧酶基因Xby1_8，并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。重组酶Xby1_8的pH和温度稳定性较好，重组菌E. coli/Xby1_8全细胞催化制备γ-氨基丁酸具有较高的转化率，在食品、工业等领域具有潜在的应用价值。
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2024,51(5):1536-1549, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230594
Abstract:
【背景】 谷氨酰胺酶(glutaminase)是一种能够催化l-谷氨酰胺水解生成l-谷氨酸和氨的酶，在食品、医药等领域有重要的应用价值。【目的】 研究不同启动子和信号肽对谷氨酰胺酶分泌表达的影响、构建能高效分泌表达谷氨酰胺酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程菌株，提高谷氨酰胺酶的产量。【方法】 选用枯草芽孢杆菌SCK6作为表达宿主，构建带有不同启动子和信号肽的谷氨酰胺酶表达载体及重组菌株，分析不同基因元件对谷氨酰胺酶表达及分泌的影响，筛选最优启动子和信号肽，组合优化，构建高效分泌表达谷氨酰胺酶的工程菌株。【结果】 实现了谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，在以PHpaII-PaprE为启动子、YndA为信号肽的条件下，摇瓶发酵胞外最高酶活达到6.7 U/mL。【结论】 通过对启动子、信号肽关键基因元件进行筛选组合，构建了一株高效分泌表达谷氨酰胺酶的菌株，为酶的高效分泌表达提供了一种有效的方法。
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2024,51(5):1550-1565, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230769
Abstract:
【背景】 针对煤燃烧过程中碱金属钠对燃煤设备和气化效率的影响，以及酸洗过程中产生酸性废水等问题。【目的】 提出利用微生物脱除煤中有机钠的新方法。【方法】 从内蒙古乌兰察布市察哈尔右翼前旗黄旗海分离、筛选一株脱除煤中有机钠的菌株，通过形态特征、生理生化特性以及16S rRNA基因序列分析对菌株进行鉴定，构建其系统发育树，通过单因素试验探究细菌最适的生长条件并绘制其生长曲线，确定煤中有机钠最佳的脱除条件，并在最佳条件下评估其脱除效果。【结果】 筛选到一株能够脱除煤中有机钠的菌株，经鉴定为水生鞘氨醇单胞菌。该菌株的最佳生长条件为：温度30 ℃、初始pH 8.0、接种量3%、装液量100 mL、摇床转速150 r/min、最佳碳源为葡萄糖(4 g/L)、最佳氮源为蛋白胨(13 g/L)；煤中有机钠的最佳脱除条件为：初始pH 8.0、装液量80 mL、煤浆浓度5 g/L、接种量7%。该条件下菌株CSW-1对煤中有机钠的脱除率为23.79%。【结论】 首次提出细菌脱除煤中有机钠的新方法，为煤炭的高效清洁利用提供了新思路。
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2024,51(5):1566-1582, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230759
Abstract:
【背景】 矿产开采会对矿场周边生态环境造成严重影响，探究矿场周边土壤养分及细菌群落结构特点对矿区周边植被恢复具有重要意义。【目的】 探究云南香格里拉普朗铜矿矿场周边不同小生境的土壤养分与细菌群落结构特征。【方法】 以普朗铜矿周边4个小生境(亚高山草甸、山谷草地、矿山林地和亚高山林地)夏季和冬季优势草本植物的根际土壤为研究对象，分析根际土壤的养分与细菌群落结构特征。【结果】 矿山林地的草本根际土壤养分含量最高，总体处于中等及以上水平。普朗铜矿周边4个小生境土壤细菌的优势菌门分别为酸杆菌门(Acidobacteriota)、放线菌门(Actinobacteriota)和变形菌门(Proteobacteria)，相对丰度占比为11.7%−60.4%，优势菌属分别为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、阿菲波菌属(Afipia)和节杆菌属(Arthrobacter)，相对丰度占比为6.1%−53.6%。Mantel分析结果表明，在细菌属水平分类下，土壤有机质对土壤细菌群落有显著影响。【结论】 夏季土壤细菌群落相对丰度显著高于冬季(P<0.05)，但夏冬两季普朗铜矿周边4个小生境之间的土壤细菌群落相对丰度和多样性无显著性差异(P>0.05)。本研究将有助于拓展对矿山生态系统的认识，可为矿区植被恢复和土壤污染治理提供理论依据。
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2024,51(5):1583-1599, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230736
Abstract:
【背景】 一些具有金属抗性的微生物被发现能降低土壤中金属的有效性，减少金属在植物中的转运和积累，同时具有促进植物生长的作用，表现出较低的成本效益和环境生态友好性，在农业、工业和环境领域具有广阔的应用前景。【目的】 分离筛选并获得耐Cd(II)优质菌株，并对其进行生物学鉴定，分析菌株形貌及耐镉的生物学特性，进一步从基因组层面剖析菌株的分子遗传特征，初步探究其潜在功能及耐重金属Cd(II)相关基因，并探究Cd(II)胁迫下菌株对小麦籽粒萌发特性的影响。【方法】 收集四川省德阳市磷矿、煤矿产区10余份土样，利用筛选培养基分离获得耐Cd(II)菌株，采用扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)、透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)观察其形貌特征；测定培养液OD600验证菌株耐Cd(II)特性。基于Illumina NovaSeq和Oxford Nanopore ONT测序平台，采用全基因组测序技术进行菌株鉴定及全基因组功能分析。利用生物信息学软件对原始数据组装、功能注释，挖掘耐Cd(II)适应机制相关基因。观察不同处理下的发芽生根率及芽根长势，研究Cd(II)胁迫下菌株对小麦籽粒的萌发特性。【结果】 分离获得一株优质耐Cd(II)菌株，经16S rrna基因测序和全基因测序鉴定为Exiguobacterium acetylicum，命名为TC13。菌株TC13全基因组序列组装得到1个染色体和1个环状质粒，大小分别为3 192 165 bp和167 401 bp；G+C含量分别为46.62%和44.63%；分别包含3 231个和154个DNA编码序列，染色体同时包含54个ncRNA。功能基因数据库比对结果发现菌种中多个基因涉及重金属转运、外排及应激响应等生物学过程，这可能与其耐Cd(II)特性有关。菌株对镉胁迫下小麦籽粒萌发率及长势特性具有显著提升作用。【结论】 本研究通过全基因组测序探究了E. acetylicum TC13的基因结构，丰富了同属种菌株遗传学信息，解析了Cd(II)耐受的相关基因，证实了菌株TC13对Cd(II)胁迫下小麦籽粒生长的促进作用，这表明菌株TC13在土壤修复及促生中具有潜在的应用前景。
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2024,51(5):1600-1613, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230578
Abstract:
【背景】 近年来，由不可接受微生物污染引发的化妆品召回案件层出不穷，现有法规《化妆品安全技术规范》(2015年版)中微生物检测指标不完善，难以满足化妆品产品质量控制和评价的需要。【目的】 对2022年化妆品国家级监督抽检中一批微生物超标面膜中污染菌进行分离鉴定，并探讨采用多种手段进行鉴定的准确性，判断是否为不可接受微生物，同时，针对污染菌进一步开展安全性评价。【方法】 参照《化妆品安全技术规范》(2015年版)对微生物超标面膜中污染菌进行分离纯化后，分别采用VITEK 2 Compact全自动生化鉴定系统、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)和16S rRNA基因测序技术对污染菌进行鉴定，并进一步开展毒力基因、耐药基因安全性评价分析。【结果】 3种技术均可鉴定出面膜中污染菌为不可接受微生物——日勾维多细菌源菌。高通量测序发现该菌携带52种毒力基因，预测含其他毒力相关基因429种，提示该菌具有极大的安全隐患。同时检测到该菌携带24种耐药基因，可能对青霉素、头孢菌素、万古霉素、四环素和氨基糖苷类等24种(类)抗生素耐药，检测到多重耐药基因10种，耐药机理多与产生外排泵有关。提示该菌存在一定的多重耐药安全风险。【结论】 本研究从一批微生物超标面膜中分离到日勾维多细菌源菌，为不可接受微生物。该菌具有极大的产毒能力，且具有一定的多重耐药安全隐患，应考虑经风险评估后将该菌纳入微生物检测指标。
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2024,51(5):1614-1625, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230668
Abstract:
【背景】 木质纤维素的难降解性是导致稻草资源产量丰富却难以广泛用于牲畜饲料的根本原因。【目的】 研究稻草微贮早期发酵过程中真菌群落演变过程及真菌对木质纤维素的降解作用。【方法】 以1.2×106 CFU/g-DM的地衣芽孢杆菌复合5×106 CFU/g-DM的植物乳杆菌添加进行稻草微贮。于不同时间节点(1、3、7和15 d)进行internal transcribed spacer (ITS)真菌群落分析。【结果】 稻草微贮的第7天真菌群落多样性最高。发酵过程中的优势菌门依次为子囊菌门(Ascomycetes) (64.2%)和担子菌门(Basidiomycota) (30.2%)。与第1天相比，子囊菌门相对丰度分别在第7天和第15天均极显著升高(P<0.001)；担子菌门相对丰度在第7天和第15天均极显著降低(P<0.001)。优势菌属依次为汉纳菌属(Hannaella) (11.6%)、伊萨菌属(Issatchenkia) (8.1%)、哈萨克斯坦菌属(Kazachstania) (6.3%)、酿酒酵母属(Saccharomyces) (6.2%)、线黑粉酵母菌属(Filobasidium) (5.1%)。枝顶孢属(Acremonium) (2.4%)和曲霉属(Aspergillus) (2.2%)是发酵过程中的次优菌属。与第1天相比，汉纳菌属相对丰度在第15天极显著降低(P<0.001)；枝顶孢属和曲霉属相对丰度均在第7天极显著升高(P<0.001)。PICRUSt预测结果表明：β-葡萄糖苷酶、漆酶、α-半乳糖苷酶和β-甘露糖苷酶是丰度最高的木质纤维素降解酶。Spearman相关性分析结果表明，担子菌门与β-甘露糖苷酶有显著正相关关系(P<0.05)。汉纳菌属与β-葡萄糖苷酶和β-甘露糖苷酶有显著正相关关系(P<0.05)。枝顶孢属和曲霉属均与β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶、漆酶和α-半乳糖苷酶有极显著正相关关系(P<0.001)。【结论】 在稻草微贮过程中，真菌对木质纤维素有降解作用。本文为真菌在微贮过程中的有效利用以及木质纤维素的生物降解提供了理论依据。
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2024,51(5):1626-1640, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230703
Abstract:
【背景】 抗氧化系统在植物抵抗逆境胁迫中起着重要作用，而共生根瘤菌是否会影响豆科植物抗氧化防御系统来提高植株抗逆性尚不清楚。【目的】 以耐逆性强的水黄皮(Pongamia pinnata)作为豆科植物代表，开展镍胁迫下的水黄皮快生根瘤菌(Rhizobium sp.) PP3回接水黄皮的盆栽实验，探究根瘤菌共生固氮对豆科植物抗氧化系统应激镍胁迫的影响。【方法】 利用酶联免疫法测定不同处理下水黄皮根、茎、叶中的4种抗氧化酶活性和4种非酶抗氧化剂含量。【结果】 水黄皮植株中的抗氧化酶活性强弱为超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)>过氧化物酶(peroxidase, POD)>过氧化氢酶(catalase, CAT)>谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)，非酶抗氧化剂含量高低为谷胱甘肽(glutathione, GSH)>类黄酮(flavonoids, FLA)>原花青素(oligomeric proantho cyanidins, OPC)>抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)；在不施用氮素和40 mg/L Ni2+胁迫处理下，接种根瘤菌PP3使水黄皮茎中的POD活性增加61.8%，叶中的SOD、GR和CAT活性增加5.7%、23.6%和36.1%；在施用氮素和40 mg/L Ni2+胁迫下，接种根瘤菌PP3使水黄皮植株根中GSH、FLA和OPC含量升高55.9%、61.6%和38.6%，水黄皮植株叶中GSH含量升高14.8%。【结论】 本研究初步揭示了根瘤菌会对水黄皮组织中的抗氧化酶和非酶抗氧化剂产生显著影响，但对不同组织中抗氧化酶和抗氧化剂的影响不同，说明根瘤菌通过介导水黄皮抗氧化防御系统来应激镍胁迫，其在镍污染土壤中强化水黄皮的抗逆性有着重要的作用。
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钱程，叶景，KhadijaEIGalai，张琴，高梦蝶，杨新宇，喻艳玲，唐松
2024,51(5):1641-1658, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230708
Abstract:
【背景】 近年来，从植物内生菌的发酵产物中挖掘抑菌活性成分已成为寻找新型生物活性成分的重要途径。【目的】寻找新的具有高效抗菌活性的植物内生菌，并探究其产生抗菌活性物质的最优发酵条件和抑菌机制。【方法】 利用组织分离法和划线法从柠檬皮和籽核中分离内生菌株，按照滤纸片和牛津杯法筛选对病原菌具有较强抑制作用的菌株，通过形态观察和16S rRNA基因序列分析确定活性菌株的分类地位，基于微孔板法检测活性菌株发酵液提取液(B02c)的抑菌效果，以单因素试验和响应面试验设计对发酵条件进行优化，并通过碘化丙啶/SYTO-9探针标记结合流式细胞术检测B02c对检定菌细胞膜的影响。【结果】 从柠檬籽核中筛选出一株对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有显著抑制作用的菌株Z10，鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)；菌株Z10的最佳发酵条件为柑橘皮渣添加量1.6 g/100 mL、pH 6.8、接种量10.0%、转速172 r/min、培养时间36 h，优化后B02c的抑菌率达到84.36%，较优化前提升16.36%；B02c对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)为3.125 mg/mL，其能够破坏金黄色葡萄球菌细胞膜的完整性。【结论】 柠檬内生菌Z10在优化发酵条件后获得的B02c对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果，在新型、高效的天然抑菌活性物质筛选及其工业化生产中具有一定应用前景。
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2024,51(5):1659-1675, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230737
Abstract:
【背景】 雪莲花(Saussurea involucrata)是一种生长在高原的珍稀濒危药用植物。对雪莲花内生真菌冷适应性的研究尚未见报道。【目的】 加深对雪莲花根内生真菌多样性及生物学特性的认识。【方法】 采用组织块分离法在4 ℃和15 ℃分离雪莲花根内生真菌；通过内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列初步鉴定菌株；根据ITS序列相似性划分可操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)，进行物种多样性分析；挑选各个OTU的代表菌株，观察代表菌株形态，考察代表菌株在不同温度的生长速度和对雪莲花幼苗生长的影响。【结果】 共获得142株内生真菌，4 ℃和15 ℃分别获得68株和74株。142株真菌隶属于2门4纲5目7科9属，聚类为14个OTU。4 ℃和15 ℃分离分别获得了10个和11个OTU，2个群落的组成有极显著差异(P<0.01)。4 ℃分离获得3个特有OTU，优势属是链格孢属(Alternaria)。15 ℃分离获得4个特有OTU，优势属是Rhexocercosporidium。14株代表菌株中发现10株深色有隔内生真菌(dark septate endophytes, DSEs)，9株具备耐冷菌或嗜冷菌特性。6株代表菌株有促进雪莲花幼苗生长的作用，其中5株是DSEs，3株是耐冷菌，2株是嗜冷菌。菌株S11和S12在15 ℃和20 ℃都有促生作用，菌株S01、S13和S14只在15 ℃有促生作用。菌株S13和S14是优势属Rhexocercosporidium的代表菌株，它们兼具DSEs、耐冷菌和促生菌的特性。菌株S01和S12在15 ℃时的促生作用更强。与20 ℃相比，菌株S01和S12在15 ℃共生时幼苗的根总长度提高2.17‒2.27倍(P<0.05)。【结论】 4 ℃和15 ℃分离获得的雪莲花根内生真菌具有丰富的物种多样性。分离温度对所获内生真菌群落的组成和结构有影响。低温分离有利于获得冷适应性DSEs。
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2024,51(5):1676-1689, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230757
Abstract:
【背景】 真菌对泡菜的风味与质地发挥着重要作用，影响泡菜及母水的储存时长。母水泡菜是我国的传统泡菜制作方法，也是保持泡菜原有风味的核心技术。【目的】 解析密闭储存泡菜母水的真菌群落动态及与理化因子的关系。【方法】 采用扩增子序列变体(amplicon sequence variants, ASV)技术监测25 ℃密闭储存30 d内泡菜母水中真菌群落的动态变化，应用流动分析仪监测母水的理化因子变化。【结果】 结合泡菜母水真菌群落动态及理化因子变化，真菌群落演替在30 d内可划分为3个时期(前期为1–5 d，中期为6–16 d，后期为18–30 d)。三个时期内共注释到真菌10门39纲98目226科461属。前期真菌构成复杂且持续变化，相互作用关系密切并受pH和总氮(total nitrogen, TN)影响；中期优势属发生变化且稀有属明显增多，互作关系减弱，并受TN调控；后期稀有属持续减少，群落结构简单，互作较少并受硝态氮(nitrate nitrogen, NN)、磷酸盐(phosphates, P)和总磷(total phosphorus, TP)影响。【结论】 25 ℃密闭储存30 d的泡菜母水，其真菌群落在前、中、后3期的演替特点各不相同。25 ℃密闭储存的泡菜母水在一周内食用更安全，也能有效保障发酵泡菜的风味，冷链储存则可适当延长保存期。泡菜体系中蕴藏的丰富真菌资源值得挖掘。
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2024,51(5):1690-1700, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230770
Abstract:
【背景】 整合子作为一种重要的耐药基因传播元件，可以通过位点特异性重组的方式捕获和表达耐药基因，在细菌耐药传播方面有着重要作用。因此，分析水产食品源大肠杆菌整合子携带情况，阐明整合子介导的大肠杆菌多重耐药现状，对水产养殖耐药监测和用药指导具有重要意义。【目的】 分析水产食品源大肠杆菌中耐药基因传播元件I、II、III型整合子的多样性。【方法】 采集浙江省某农贸市场凡纳滨对虾、太平洋牡蛎和太平洋鲭鱼样品各160份，利用伊红美蓝选择性培养基和PCR法分离鉴定大肠杆菌，采用Kirby-Bauer纸片扩散法分析菌株对9类19种抗生素的耐药特征，并通过PCR法分析菌株携带的整合子及其基因盒多样性。【结果】 各160份凡纳滨对虾、太平洋牡蛎和太平洋鲭鱼样品中依次分离到大肠杆菌15株、59株和26株，共计100株，大肠杆菌分离株多重耐药率依次为93.3% (14/15)、76.3% (45/59)和80.8% (21/26)。大肠杆菌分离株的I型整合子携带率为71.0% (71/100)，II型整合子携带率为5.0% (5/100)，未检出III型整合子。共分离到10种不同阵列的I型整合子-基因盒和3种不同阵列的II型整合子-基因盒，其中II型整合子-基因盒dfrA1-catB2-sat2-aadA1为首次在大肠杆菌中发现。Pearson相关性分析显示，水产食品源大肠杆菌的整合子携带率与菌株多重耐药性之间具有显著正相关性(相关系数r=0.99，p<0.05)。【结论】 本研究对进一步揭示整合子介导的水产食品源病原微生物耐药基因传播机制、促进水产养殖业健康发展具有一定意义。
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2024,51(5):1701-1712, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230642
Abstract:
【背景】 牛结核病是一种重要的人兽共患传染病，主要由牛分枝杆菌引起，阻碍养殖业发展，并在世界范围内造成巨大经济负担。【目的】 制备牛结核分枝杆菌CFP-10蛋白单克隆抗体，建立牛结核病竞争ELISA方法并对其进行初步应用与评估。【方法】 以rHis-CFP-10蛋白作为免疫原，采用小鼠杂交瘤融合技术获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，选用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，并对其纯化后进行辣根过氧化物酶标记。基于CFP-10单克隆抗体建立牛结核病竞争ELISA方法，对155头奶牛采用商品化BOVIGAMTM试剂盒与建立的竞争ELISA检测方法进行同步检测，验证该方法适用性。【结果】 获得一株稳定分泌CFP-10特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株8E6，获得酶标抗体HRP-8E6并建立竞争ELISA方法。棋盘法确定包被抗原CFP-10-ESAT-6融合蛋白的工作浓度和酶标抗体HRP-8E6的稀释倍数分别为0.75 μg/mL和1:8 000，该方法Cut-off值为47.10%，检测限为0.800 μg/mL；其重复性良好，批间与批内试验变异系数均小于10%；敏感性为54.55%，特异性为100.00%。临床检测显示，与BOVIGAMTM试剂盒相比，阳性符合率为78.57%，阴性符合率为82.35%，总符合率为80.65%。【结论】 制备一株CFP-10特异性抗体，并使用特异性高的CFP-10-ESAT-6融合蛋白建立竞争ELISA检测方法，该方法准确、可靠，可应用于牛结核病的检测。
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2024,51(5):1713-1731, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240100
Abstract:
【背景】 拟无枝酸菌属作为一类重要的稀有放线菌，是抗菌、抗癌类药物的重要来源，其合成天然产物的潜能尚待系统分析及发掘。【目的】 揭示拟无枝酸菌属不同结构类型次级代谢产物合成潜能，并建立两个代表性菌株的遗传操作体系，为结构新颖或生物活性优良的次级代谢产物发掘及研究提供条件。【方法】 使用多位点序列分析(multi-locus sequence analysis, MLSA)方法评价已公布的拟无枝酸菌基因组之间的相似度。同时，使用antiSMASH分析所有基因组的基因簇，预测其合成产物结构信息，并利用BiG-SCAPE对基因簇进行聚类分析。利用pSET152整合载体优化两个代表性拟无枝酸菌的接合转移条件，以建立遗传操作体系。采用CRISPR-cBEST碱基编辑和传统的同源重组确定靶基因失活方案。【结果】 146个拟无枝酸菌基因组的生物信息学分析显示，平均每个基因组中含有33个基因簇。其中聚肽、聚酮及萜类合成基因簇的丰度较高，并且大多数基因簇与已知化合物基因簇不同。成功确定了拟无枝酸菌属两个代表菌株的最适接合转移条件。尽管CRISPR基因编辑质粒能够转入拟无枝酸菌，但6个载体均未成功编辑目标基因，而利用传统同源重组方法则成功敲除目标基因，建立了目的基因敲除系统。【结论】 次级代谢潜能分析显示拟无枝酸菌属中蕴含丰富的新颖天然产物资源。此外，成功建立的基因编辑体系实现了外源基因整合及内源基因敲除，为该属新颖次级代谢产物的挖掘及生物合成研究提供了坚实的研究基础。
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2024,51(5):1732-1740, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230768
Abstract:
【背景】 新疆是棉花生产的主要地区，枯萎病的发生严重影响着棉花的产量。目前，关于棉花枯萎病原菌的发病机制尚无详细报道。【目的】 在尖孢镰刀菌突变体库中筛选出致病力降低的突变体并分析其致病基因，以阐明棉花枯萎病菌的致病分子机制。【方法】 在前期已建立的枯萎病菌突变体库的基础上，对随机挑选的136份突变体致病力进行鉴定，并对其表型和侧翼序列进行分析。【结果】 获得5个致病能力明显降低的突变株，突变体B-18的形态与野生型有差异且菌落颜色变为紫色；5个突变体生长速率均降低，其中B-18下降最明显；5个突变体产孢数量均降低。扩增5个突变体，测序后经Blast比对分析，确定了T-DNA在枯萎病菌基因组的分布情况。【结论】 对筛选出的5个致病力缺陷的突变体进行分析并找到致病基因，为研究棉花致病基因的功能和克隆提供了坚实的理论基础。
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2024,51(5):1741-1753, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230833
Abstract:
【背景】 食用菌交配型和单单杂交杂合子的鉴定通常采用显微镜检测观察是否具有锁状联合的方式进行，存在耗时长、工作量大且易出现误检等问题。【目的】 建立一种鉴定香菇单核体交配型和单单杂交后代的分子辅助育种技术，为提高育种效率提供技术支撑。【方法】 利用交配型因子保守序列单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism, SNP)位点设计分型引物，建立等位基因特异性PCR (allele-specific PCR, AS-PCR)技术，鉴定香菇L808和YX7的单孢分离株交配型及其杂交后代。【结果】 AS-PCR鉴定结果表明，L808的38个单孢分离株中，交配型为A1B1、A2B2、A1B2和A2B1的单核体分别有6、13、8和11个；YX7的45个单孢分离株中，交配型为A3B3、A4B4、A3B4和A4B3的单核体分别有15、8、8和12个，交配型为A3A4B3B4的异核体2个；12个单单杂交菌株中，10个为真正的杂合子，2个为非杂合子。传统方法与AS-PCR分子鉴定结果完全一致，但前者容易将异核体误判为单核体。【结论】 基于SNP位点的AS-PCR技术能有效鉴别香菇单核体交配型和单单杂交后代，区分单核体与异核体，具有精准、高效的特点，是一种香菇分子辅助育种的理想工具。
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2024,51(5):1754-1765, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230845
Abstract:
【背景】 溶瘤病毒生物治疗是肿瘤治疗发展的新方向，其中新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)因具有生物安全及靶向性强等优势备受关注。然而，中和抗体的病毒清除将削弱溶瘤病毒的持续有效发挥的作用。基于肿瘤细胞源性的微囊泡递送体系有望解决上述瓶颈，因此微囊泡包裹溶瘤病毒的制备具有非常重要的现实意义。【目的】 探究建立基于肿瘤细胞源性的新城疫病毒微囊泡递送体系和评估其体外杀瘤效应。【方法】 采用差速离心的方法，提取出微囊泡包裹的新城疫病毒(MV@NDV)；粒度仪检测MV、NDV、MV@NDV的粒径大小；透射电子显微镜观察MV@NDV中MV和NDV的相对位置；免疫印迹技术(Western blotting, WB)检测MV@NDV的Integrin β-1、Gpc 3和Flotillin-1蛋白表达；激光共聚焦显微镜观察MV@NDV感染Hepa 1-6细胞24 h，细胞NDV-HN蛋白表达；倒置显微镜和CCK-8法分别检测感染Hepa 1-6细胞24、48、72 h的细胞形态以及活力变化；实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)和免疫印迹技术(WB)分别检测MV@NDV感染Hepa 1-6细胞24 h凋亡相关基因Caspase-3和Caspase-9表达以及凋亡相关蛋白Caspase-3表达。【结果】 粒径和透射电子显微镜检测结果表明MV粒径范围为141−342 nm，NDV粒径范围为91−825 nm，MV@NDV粒径范围为164−712 nm。WB结果表明MV@NDV能够表达MV所表达的Integrinβ-1、Gpc 3、Flotillin-1蛋白。激光共聚焦显微镜观察结果表明MV@NDV、NDV感染Hepa 1-6细胞，出现红色荧光，均表达NDV-HN蛋白。CCK-8结果表明MV@NDV组与NC组相比，Hepa 1-6细胞活力下降(P<0.05)。qPCR结果表明MV@NDV与NC组相比凋亡相关基因Caspase-3和Caspase-9均上调(P<0.05)。WB结果表明MV@NDV与NC组相比凋亡相关蛋白Caspase-3上调(P<0.05)。【结论】 成功构建NDV微囊泡递送体系MV@NDV，有望解决治疗型溶瘤新城疫病毒在临床转化上存在的瓶颈，为临床新城疫病毒抗肿瘤方面提供新的思路及依据。
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2024,51(5):1766-1773, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.231042
Abstract:
耕读教育是弘扬中华优秀传统文化的重要抓手、推动涉农高校教育改革的重要载体和实现德智体美劳“五育”融合的实践方式。近年来，华中农业大学以导师躬行践履涵育微生物学人才“三农”情怀，以产学研用联动打造耕读教育特色育人课程体系，以五育融通创新耕读教育实践育人模式，在“耕” “读”融通中提升微生物学相关专业学生的知农爱农情怀和强农兴农本领。
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2024,51(5):1774-1783, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230424
Abstract:
“发酵工程专业课程设计”是湖南大学生物学院面向生物技术专业学生开设的特色本科实践环节课程，旨在加强学生实践和运用能力，鼓励学生将习得的微生物学和发酵工程知识在发酵工厂的实际应用中找到落脚点。传统的教学模式中，这门课程主要以课堂讲授为主。由于涉及发酵生产线运行、发酵设备参数设计等实践性较强的内容，单纯的课堂讲授不易调动学生的课堂积极性，同时也难以让学生对授课内容产生直观清晰的认识。在此背景下，我们针对课程进行了改革优化，在课程教学中全面引入虚拟仿真教学和工厂实践的教学模式。力争通过新模式下“发酵工程专业课程设计”的教学实施，加强学生对发酵工程原理的掌握，并强化学生的实践和运用能力。本文总结了现阶段课程“课堂+仿真+工厂”三维一体的开展模式，并结合学生反馈对实际授课效果进行了反思，以期为高等院校教学改革提供参考。
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2024,51(5):1784-1797, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.231023
Abstract:
微生物学实验是高等院校生命科学、食品科学等多个学科专业重要的学科基础课程，具有很强的实践性和应用性，在生物类创新人才培养过程中发挥着重要作用。基于当前地方高校微生物学实验课程存在的教师满堂灌、内容单一、学生参与度不高、考核方式不科学等突出问题以及工程认证和一流课程建设的要求，本教学团队建立了“123+2n”教学改革创新体系，从教学理念、教学内容、教学方法、考核方式和评价方法等方面进行了创新改革，旨在激发学生的学习热情，发挥学生的主观能动性，提高学生的创新意识和工程实践能力，实现“价值塑造、知识传授和能力培养”三位一体的教学目标。经过实践，学生学习兴趣、分析解决问题及创新能力显著提升，这一新型的教学改革创新体系可为当前地方高校实验课程的教学改革提供参考。
