RIP技术|双荧光素酶报告系统（小白文献阅读笔记本）

RNA结合蛋白免疫沉淀

RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation），是研究细胞内RNA 与蛋白结合情况的技术，应用领域包括转录后调控研究、表观遗传调控，可以发现miRNA的调节靶点。RNA结合蛋白(RBP)参与mRNA的转录和成熟包括加工、转运、稳定、降解和翻译等生物过程；同样，一些mRNA分子在转录后水平受到核糖核蛋白复合体（RNP）的调节。

针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行q-PCR验证或测序分析。

大概的实验流程：

1.收集细胞
2.分离细胞核，裂解细胞核沉淀
3.染色质片段化
4.将所关注的 RNA 结合蛋白 (RBP) 和结合的 RNA 一起进行免疫沉淀
5.洗去未结合的物质
6.纯化免疫沉淀后 RBP 上结合的 RNA
7.将 RNA 逆转录为 cDNA，通过 qPCR、微阵列或测序进行分析

在学习下一个实验方法前先了解一些知识

启动子Promoter：是RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列，它含有RNA 聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录。

转录因子Transcription factors，TF：真核生物转录起始过程十分复杂需要多种蛋白因子的协助。转录因子与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合体，共同参与转录起始的过程。根据转录因子的作用特点可分为二类；第一类为普遍转录因子，在它们与RNA聚合酶Ⅱ共同组成转录起始复合体时，转录才能在正确的位置开始。第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子，这些TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素\生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。

转染：细胞转染是指将外源分子，如重组质粒载体、游离核苷酸等物质，在导入真核细胞的实验技术，有显微注射、磷酸钙法、脂质体/聚合物法和电转法

双荧光素酶报告系统

荧光素酶可以催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin，在氧化的过程中会发出生物荧光（ bioluminescence），用荧光测定仪（ luminometer）或液闪测定仪测定luciferin来检测荧光，是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。转录因子的作用强度与荧光素酶的表达量成正比。

将待检测的调控元件（启动子）安排在荧光素酶基因的上游，构建成载体，然后将构建完成的载体导入到合适的动物细胞中，通过检测荧光素酶的活性来判断调控元件的活性。最常用到的就是双荧光素酶，即其中一种荧光素酶作为报告基因，另一种则作为内参，可以减少外界因素对于实验数据产生的影响

大致过程：

1、构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒

2、将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染进细胞培养，如果转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达

3、加入特定的荧光素酶底物，产生荧光，检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性