载体构建的"利器"--Golden Gate

众所周知，基因功能研究，离不开分子生物学实验，而分子生物学实验又绕不开载体构建。依赖于限制性核酸内切酶的载体构建，其工作原理是分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。目前常用的载体构建系统有：基于TypeII型限制性内切酶的载体构建系统、基于TypeIIs型限制性内切酶的Golden Gate载体构建系统。

与基于TypeII型限制性内切酶的载体构建系统不同，Golden Gate载体构建方法，可实现在单一管内同时进行酶切和连接反应，不需要进行凝胶纯化及分步的酶切、连接反应，大大缩短实验时间，并且重组克隆不会残留酶切位点，真正做到“无缝”拼接，重组效率高。今天小远就为大家重点介绍一下Golden Gate载体构建系统，希望大家看完本文后会对该系统有一个更全面的认识！

背景介绍

Golden Gate载体构建方法最早是由Engler等人在2008年提出的(Engler et al. 2008)。该方法是一种新型的酶切连接方法，与传统的酶切连接不同。传统的酶切连接方法采用标准的TypeII型限制性内切酶（例如EcoRI）切割DNA，这些限制酶通常识别4~8bp的回文序列，并在识别序列内部切割产生粘性末端或平末端。而Golden Gate是采用TypeIIs型限制酶（例如BsaI）切割DNA，这些酶是在识别序列以外剪切产生四个碱基的粘性末端（图1）。由于粘性末端不是识别序列的一部分，因此它们可以直接作为连接DNA的片段。在设计无误的情况下，识别位点不会出现在最终的质粒中，达到精确的无缝克隆，连接效率接近100%。此外，四个碱基的特异性末端能用来连接多个片段，从而在一个反应体系中实现多片段的克隆重组。

构建流程

(1)设计引物扩增目的片段

通过PCR向目的片段中引入IIs型限制酶（如BsaI、BsmBI等）的识别序列，识别序列加在引物的5'端，为了确保限制酶能稳定结合到DNA双链上并发挥切割作用，需在识别序列末端加上保护碱基。所加的保护碱基的数量和种类不是固定的，一般3bp的保护碱基就是足够的，但如果为了保险起见，也可以将保护碱基增加至6bp。另外，为了帮助大家更好的设计引物，我司官网专门开发了Golden Gate克隆引物设计网址（http://www.biorun.com/tools/）欢迎大家点击使用。

(2)酶切连接

利用TypeIIs限制性内切酶（BsaI）识别目的片段和载体上的酶切位点，并在酶切位点之外进行酶切。之后，在连接酶的作用下将目的片段和载体进行无缝连接，可实现单片段克隆重组（图1）或多片段重组（图2）。并且，在合适的实验条件和实验设计下，利用Golden Gate可以组装超过20个DNA片段。