微生物是一群以分解代谢为主的生物类群，其生物活性十分丰富。根据微生物的生物特性，从物种、生理代谢类群及遗传背景几个方面探讨微生物多样性的问题，使人们更加的了解微生物的多样性，更加全面的认识微生物的多样性为，解决人类目前面临的诸多问题提供更多的途径。基因组时代的到来,为研究微生物群落结构提供了新的技术平台，将一个全新的微生物世界展现在人们面前，它充分显示了微生物的生物多样性，并揭示了生物进化的动力。其中，16S rRNA基因测序已经成为当前研究微生物群落组成及其分布的重要手段。
细菌核糖体的结构
原核生物有 16S、23S及 5S三种 rRNA，这三种rRNA均存在于30S的rRNA前体中。转录作用完成后，在RNaseⅢ催化下，将rRNA前体切开产生16S、25S及 5S rRNA的中间前体。进一步在核酸酶的作用下，切去部分间隔序列，产生成熟的 16S、23S及5S rRNA，还有成熟的 tRNA。
真核生物的核蛋白体中有18S、5.8S及5S rRNA。 5SrRNA自己独立成体系，在成熟过程中加工甚少，不进行修饰和剪切。 45S rRNA前体中包含有 18S、5.8S及 28SrRNA。在加工过程中，分子广泛地进行甲基化修饰，主要是在28S及18S中。
S为沉降系数，当用超速离心法测定一个粒子的沉淀速度时，此速度与粒子的大小直径成比例。5S即含有120个核苷酸，16S含有1540个核苷酸，而23S含有2900个核苷酸。
16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA），简称16S rRNA，是原核生物的核糖体中30S亚基的组成部分。16S rRNA的长度约为1,542 nt。卡尔·乌斯和乔治·福克斯是率先在系统发育中使用的16S rRNA基因的两个先驱者。研究发现物种间16S rRNA序列既有高变区（V区，物种之间有差异）也有保守区（物种之间高度相似），呈交替排列，原核16S rRNA序列包含9个高变区，其中，V4-V5区其特异性好，数据库信息全，是细菌多样性分析注释的最佳选择。保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而可变序列区域则能体现物种间的差异，因此，16S rDNA也被称为细菌系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟。
分子钟：即氨基酸在单位时间以同样的速度进行置换。
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细菌16S rRNA基因序列组成及引物选择
微生物多样性测序是基于二代高通量技术对16S rRNA基因序列进行测序，能同时对样品中的优势物种、稀有物种以及一些未知的物种进行检测，获得样品中的微生物群落组成以及它们之间的相对丰度。探讨微生物多样性对于研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用有着重要的理论和现实意义。目前市面上常用的用于研究环境微生物的高通量测序平台有Illumina MiSeq，Roche 454和Ion Torrent PGM。针对于细菌的16S rRNA基因序列分析，MiSeq凭借其测序读长长、测序周期短、通量大等特点，成为使用最为普遍的测序平台。目前用于16S rRNA基因深度测序的区域主要有V4区，V3-V4区、和V4-V5区等。
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需要扩增的特定16S rRNA基因区域引物
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生物信息学分析基本内容
16S rRNA基因测序区域和测序深度对菌群α多样性指数分析具有明显影响，增加测序深度可以检测到样本中极低丰度微生物类群。鉴于Illumina MiSeq高通量测序平台读长及测序成本等问题，基于引物515f和806r扩增的V4区测序被广泛使用，是发起于2010年的地球微生物组计划(Earth Microbiome Project，http://www.earthmicrobiome.org/)建议使用的测序引物及区域。引物515f和806r由Caporaso等设计，对微生物覆盖度高，同时也可以检测到部分古菌类群。然而Parada等发现该引物对会对Gammaproteobacteria造成高估，因此对其进行了优化。有研究表明，在同一测序深度下，V4区测序获得的菌群中Gammaproteobacteria的相对丰度是2.31%，高于V3−V4区测序获得的菌群中Gammaproteobacteria相对丰度是1.43%。更长的序列信息意味着可用于反映种属亲缘关系的位点数增多，能够更准确地进行物种分类分析。
常见问题
1. 16S rDNA测序可鉴定到菌何种分类水平？
由于16S rDNA测序是通过扩增某个或某几个高变区来检测，一般可精确到“属”水平，少数可鉴定到“种”。对于某些菌，高变区中序列的相似度非常高；或者区分不同菌的序列片段不在我们的扩增区域内，均会导致无法鉴定到“种”。
2. 16S rDNA和宏基因组有何区别？
16S rDNA和宏基因组在分析上不少相同之处，如进行物种分类、丰度分析、菌群比较等。不过16S rDNA的功能预测准确度相对较低，只能做到KEGG的第三层级。而宏基因组可以开展基因水平的分析，通过对基因序列进行功能注释，分析不同基因的基因功能、参与的生物通路和抗生素抗性能力等。研究环境微生物，通过结合16S rDNA和宏基因组测序两种技术手段，可以更准确地研究群落组成、多样性、进化关系以及基因功能等。
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